曲线恢复正常后，该数据能够采用需根据复孔重复性进一步判断。这些情况都会使得扩增曲线异常，不是标准的s形。因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况,需要根据具体实验设计和目的进行。PCR产物设计超过500bp；5.模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。适当降低引物浓度,并注意上下游引物的浓度配比。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。可适当降低退火温度或改为三步扩
pcr退火操作?大家在做 PCR 实验的过程中，有没有遇到一些奇奇怪怪的问题？我们经常会收到一些老师们的咨询，为了能统一给大家参考，小卓特地给大家整理一篇，挑出几个有针对性的问题，统一进行解答，接下来我们就来聊聊关于pcr退火操作?以下内容大家不妨参考一二希望能帮到您!
pcr退火操作
大家在做 PCR 实验的过程中，有没有遇到一些奇奇怪怪的问题？我们经常会收到一些老师们的咨询，为了能统一给大家参考，小卓特地给大家整理一篇，挑出几个有针对性的问题，统一进行解答。
01、只有熔解曲线，没有扩增曲线？
可能是在 PCR 循环时没有设置采集荧光的步骤，而熔解曲线默认采集荧光，所以最后结果只有熔解曲线，没有扩增曲线。
TIPS：在 set up 的 run methods 里，如果把 40 个扩增时 60 度 1 分钟后下面的小方框单击去掉，这时就不会采集荧光信号了。按理说后面的溶解曲线也不会出现，只能在 multiple component 那里才能看到。
02、部分扩增曲线向下弯曲
可能是基线终止循环设置不正确，可以手动设置基线，重新分析即可。
TIPS：在 analysis 选项里，可以将基线的 auto 设置前的勾去掉，则可以对基线进行手动设置。拉动 x 轴下方的小三角形，往 ct 值大的方向拉动，重新 analysis，然后选择线性图，可以看到扩增曲线会变形。或者可以在 analysis settings 中，手动修改基线的起始和终止循环。
03、高浓度 ROX 校正，扩增曲线呈锯齿状断裂
可能是试剂中的参比荧光染料 ROX 浓度与仪器机型不匹配导致的 Badrox，往往出现在需要高浓度 ROX 校正的 ABI 7900HT、StepOne 等仪器上。
可在「Setup」中进行设置，将「Passive Reference」的「ROX」调整为「None」，扩增曲线即恢复正常。曲线恢复正常后，该数据能够采用需根据复孔重复性进一步判断。
04、扩增曲线不是标准的 S 形
探针质量不好，比如部分降解会干扰基线且使得 PCR 效率不高；试剂质量不好也会出现 PCR 效率不高等问题。这些情况都会使得扩增曲线异常，不是标准的 s 形。
05、熔解曲线有些孔是单峰，有些是双峰
如果熔解曲线出现双峰，证明扩增产物中有两种产物，可能是引物二聚体或非特异性产物。可以重新设计引物，或者优化 PCR 反应条件。
06、加样重复样品 Ct 值重复性不够好
重复性不好的原因很多，大部分是因为加样不准确。
07、标准品相关系数不佳
1.标准品浓度太低，即使是最高浓度也是标准品 Ct 值也大于 25 接近 30，低浓度的 DNA 样品保存时间较长会有降解现象出现，因此建议将标准品浓缩。
2.标准品倍比稀释不好，建议 10 倍比稀释，且采用逐步倍比稀释的办法。比如将 10 v 的高浓度标准品 a 加入 90 v 的水中得到 10 被稀释后的标准品 b，彻底混匀之后再吸取 10 v 的 b 加入 90 v 的水中。
08、使用默认检测荧光 HEX 标记探针，信号会非常弱
需要通过添加 customer dye，对 HEX 进行校正。（HEX 不是 Applied Biosystems（ABI）进行过校准的荧光，所以同学们使用这类荧光标记探针时，必须使用纯的荧光[即 customer dye]运行一次进行校正。）
09、扩增曲线尾部出现弯折
1.仪器长时间未校准，在检测中出现了波动，建议定期校准仪器；
2.RNA 模板不纯，建议增大模板稀释倍数或者重新制备较高纯度的 RNA 模板。
10、没有ct值
检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题：
1.循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准)；
2.PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中；
3.引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解；
4.模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可),对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融；
5.引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
11、标准曲线不佳
标准曲线线性关系不佳R2<0.9,很有可能是以下环节存在问题：
1.标准品稀释或者加样误差,使得标准品不呈梯度；
2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,将高浓度DNA模板分装,保存于-20℃或-80℃,现配现用；
3.引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针；
4.模板中存在抑制物。模板浓度过高,根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求,一般模板量以50—500ng为宜。
12、ct值过晚
在相对定量中,Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中,对低拷贝数的样品,Ct值会增大,但是一般不宜超过40循环,否则定量不准确。因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况,需要根据具体实验设计和目的进行。
1.扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适,需要进行优化;引物或探针设计不合理,需要重新设计；
2.PCR程序不合适,改用三步法进行反应,或者优化退火/延伸温度,可以适当降低退火温度;退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s)；
3.MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足；
4.PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp；
5.模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
13、熔解曲线峰不特异
熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题:
1.引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现;引物浓度不佳,尤其是涉及二聚体存在时,适当降低引物浓度,并注意上下游引物的浓度比例;
2.模板有基因组污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。
3.离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix试剂盒,不同试剂盒在该方面的优化能力不适合,有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果。
14、阴性对照扩增有信号
照扩增有信号排查各操作环节是否有不当,造成交叉污染：
1.引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。适当降低引物浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix试剂盒。
4.模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。
5.交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染,或操作环境中有气溶胶造成污染,建议对操作环境进行处理,或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。
15、扩增曲线异常
遇到扩增曲线异常,比如“S”型曲线等等情况,有可能是以下环节存在问题：
1.模板的浓度太高或者降解；
2.荧光染料的降解；
3.在操作荧光定量PCR时,带上新的一次性手套,盖上避免任何指纹或者字迹等；
4.液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里；
5.气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。
16、扩增效率低
该情况适用于针对所有的基因,特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应考虑如下情况:
1.反应试剂中部分成分比例是否最佳,另外考虑荧光染料是否降解；
2.反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法,适当延长变性退火时间；
3.反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入的,应先把模板适度稀释,再加入反应体系,减少抑制物的影响。
17、没有扩展条带
1.酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
2.变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
3.反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Taq 酶以前，将反应体系 95℃ 加热 5~10 分钟。
4.引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
5.引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
6.DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是 DNA 凝胶和 PCR 程序的问题。
7.模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。
18、PCR 产物量过少
1.退火温度不合适。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
2.DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。
3.PCR 循环数不足。增加反应循环数。
4.引物量不足。增加体系中引物含量。
5.延伸时间太短。以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。
6.变性时间过长。变性时间过长会导致 DNA 聚合酶失活。
7.DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA 模板干净。
19、扩增产物跑电泳条带弥散
1.酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
2.dNTP 浓度过高。减少 dNTP 的浓度。
3.MgCl₂ 浓度过高。可适当降低其用量。
4.模板量过多。质粒 DNA 的用量应<50 ng，而基因组 DNA 则应<200 ng。
5.引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 PCR 反应。
6.循环次数过多；增加模板量减少循环次数至 30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的 PCR 循环。
6.退火温度过低。
7.电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。
8.若为 PCR 试剂盒则可能：
①由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
9.降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
20、扩展产物出现杂带
1.引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
2.循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
3.酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
4.退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 PCR 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
样品处理不当。
5.Mg2浓度偏高，因适当调整 Mg2使用浓度。
6.若为 PCR 试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
7.复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
8.反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
9.引物特异性差。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
10.引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
11.模板量过多。质粒 DNA 的用量应<50 ng，而基因组 DNA 则应<200 ng。
12.外源 DNA 污染。确保操作的洁净。
21、条带大小与理论不符
1.污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
2.模板或引物使用错误。更换引物和模板。
3.基因亚型。对研究的基因进行序列分析和 BLAST 研究。
22、阴性对照出现条带
试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
今天的知识分享就讲到这里，关于PCR实验中的常见问题，你都了解了吗？有任何疑问，欢迎咨询您身边的卓诚人，我们将不懈努力，为您提供更优质的产品和服务！
