可见，粒子辐射跃迁从620-850nm均有可能，在670nm处几率最大。StefanHell则灵光一闪，提出可以把受激辐射和自发辐射分开。这就是GSD，全名Groundstatedepletion，基态清空。由于GSD是将粒子激发到高能自发辐射级，与STED强制让粒子做受激辐射而不是自发辐射相比，其所需能量可能会小很多。Hell组一直致力于MMM的研究，全名叫做MultiphotonMultifocalMicroscopy。将这—并行成像技术应用于STED或者GSD，可十几倍地提升成像速度。
作者：席鹏、李美琪
北京大学工学院生物医学工程系
早在2009年，Nature Publishing Group便空前的为超分辨显微频繁出新专辑，足以反映光学超分辨的热度。
那么，什么是光学超分辨？如何实现光学超分辨？
山穷水尽疑无路
显微的发展离不开光学，而光学的发展需要三大件：理论、材料、工程。这三大件，居然在20世纪初的德国小镇耶拿相聚了。那里有光学泰斗阿贝Ernst Karl Abbe、光学玻璃大家Otto Schott和光学工程大师Carl Zeiss。后两人都同时进入商界，并以他们的家族名称作为公司的名称，至今仍是世界上数一数二的巨头。
阿贝则深入研究了在传统光学中，如何能够提高分辨率，以及是否能够无限提高分辨率的问题。光学显微由于光束直径有限，透镜大小有限，会产生衍射，从而具有—个所谓的衍射极限：
这个式子也是一个点扩展函数(PSF)的半高全宽的描述。它说明如果一次把处于这个半径里面的粒子亮起来，那用光学显微是无法分辨它们的。所以，这个公式也就是光学显微分辨率的描述。
STED--You jump，I jump
Stefan Hell提出：是否可以通过两步的方法来实现分辨？
这个问题如果用通俗的语言描述，就是，如果你有一根粗笔，如何用它画细线？
你可能会想到，买块橡皮。先画个粗的，再擦去两边的多余部分，自然就是细线了。没错，STED用的就是这个原理。
STED，全名是Stimulated Emission Depletion，受激辐射光淬灭。如下图所示STED系统结构示意图，在右上角，有—副能级图。其中，你看到红色的箭头和黄色的箭头了吗？
图 STED系统结构示意图
绿箭头代表粒子从低能级S0被激发到高能级S1，然后又弛豫到亚稳态-高能级的最低点。接下来粒子会在这休息一下，这个短到几个纳秒的快乐时光被叫做粒子的寿命(lifetime)。然后粒子选择不在S1，回到S0，正所谓“吾欲乘风归去，又恐琼楼玉宇，高处不胜寒......”
这大概是绝大多数电子的选择。跳下来的时候它们会降落在S0能级的不同高处，并形成—定的分布。这个分布我们可以用发射光谱来描述其统计特性，如下图某染料ATTO 647N的激发光谱（蓝色曲线）与发射光谱（红色曲线）。可见，粒子辐射跃迁从620-850 nm均有可能，在670 nm处几率最大。
图 荧光吸收与发射光谱
“这样不好”，有一个同学突然站起来说，“看着不整齐。”他就是爱因斯坦。相信大家都看过《泰坦尼克号》，“如果Rose遇到了Jack，那么他俩会一起跳，不分你我”。后来发明的激光Laser，其中的SE就是受激辐射。正因为这整齐划一的一跃，使得激光成为功率最强的光。
Stefan Hell则灵光一闪，提出可以把受激辐射和自发辐射分开。
先返回到刚才那个黄箭头和红箭头。如果绿色箭头引发的荧光现象的最小PSF是绿色的圆圈半径，这时候如果给它套上—个红色橡皮擦（粒子做受激辐射波长相同），不就剩下为数不多、居于中间的荧光了吗？缩小点扩展函数，这不就是超分辨吗？
选—种合适的荧光物质，按顺序先给激发脉冲(2 ps左右），等它跃迁上去了马上给—个受激辐射波长的脉冲(250 ps左右），然后用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射，探测过来的自发辐射信号。受激辐射越大（橡皮摇得干净），剩下的PSF越小，也就是分辨率越高。这个就是Pulsed STED。当然，如果觉得时间控制太麻烦，其实可以都给连续信号，因为反正二向色镜能区分，只不过擦得没那么干净，这个就是cw STED。
图 共聚焦与STED的对比（图像来源：Leica网站）
图 麻省理工大学制作的爱因斯坦－梦露图
你看出爱因斯坦和梦露了吗？
釜底抽薪GSD
前面说到，STED通过类似橡皮擦的功能来将点扩展函数变小。有同学说，我不用橡皮擦，—样能用粗笔画细线啊。只要找两张纸，对成一个细缝，然后再画就可以了。生活中许多标记也是这么做的。
图 利用粗的喷枪可以画出非常精细的图案，只需要—块掩模板即可实现
但是，这和超分辨有什么联系呢？让我们再回头仔细看看下方能级图。
图 STED和GSD的能级图
从图中可以看到，如果我们刚开始就把周围的粒子通过—个强激发扔到九霄云外，让他们自己慢慢回到—个不发光的triplet state，这时候能够被激发的就只有中心的粒子，也就自然而然地减小了点扩展函数。这就是GSD，全名Ground state depletion，基态清空。
由于GSD是将粒子激发到高能自发辐射级，与STED强制让粒子做受激辐射而不是自发辐射相比，其所需能量可能会小很多。2010年，Hell课题组利用钻石中氮空穴中心实现光切换，实现了12 nm分辨率的GSD成像结果，其GSD所采用光强仅为STED的千分之—。
图 共聚焦与GSD成像对比
没错，这一点成像无疑是超分辨了，但是当你挪到下一点的时候，刚才被你扔到九霄云外的粒子还没有回来，怎么办？这里有两个办法：
●笨办法，等下去，直到它回来。这样的话，如果粒子在T1，及沿途的时间为1 ms，则每一个像素的积分时间将不得少于1 ms，也就是做—个500 X500的图像，你需要4分钟以上；
●通过并行测量来加快速度。Hell组一直致力于MMM的研究，全名叫做Multiphoton Multifocal Microscopy。将这—并行成像技术应用于STED或者GSD，可十几倍地提升成像速度。
RESOLFT删繁就简二月花
前面的部分，我们讲到了利用STED进行先激发再擦除，或者利用GSD进行先擦除再激发，均可实现超分辨率显微。
它们的本质是什么？有没有别的渠道？
下图展示了STED的能级，其中，我们要做的就是区别红箭头（受激辐射）和黄箭头（自发辐射）。既然如此，把红箭头掰到方向跟黄箭头相反（使其向上发展），则更容易区分。实验上，完全可以让粒子在激发态的时候keep going，通过Excited State Absorption(ESA)来擦除它。Hell组曾经利用ESA实现了对掺猛的量子点的超分辨。
图 STED能级图（左）和另一种超分辨的能级实现模式
一个箭头，扭转乾坤。
回答我们刚开始提出的问题本质上，这—类的方法都是抑制粒子处于激发态的几率，也就是不让它在S1态，不管是在摇篮中扼杀(GSD)，到达后拉下来(STED)，还是将其送上西天(ESA)。
图 利用不同的能级跃迁模式，能够实现点扩展函数的直接调制
这—方法被Stefan Hell称为RESOLF（Reversible Saturable/Switchable Optical Transitions）可逆饱和/开关光跃迁。我们讲到的STED/GSD/ESA都可以统—地概括在它下面。
下次，我们将介绍另外两种独辟蹊径的超分辨成像机理，以及它们之间的内部联系。
